单克隆抗体中常见问题

时间：2023-09-25 09:18 | 栏目：第2节动物细胞工程 | 点击：次

单克隆抗体中常见问题

1．不同细胞的融合

与骨髓瘤细胞融合的是B细胞还是浆细胞，以及融合前是否要先从脾脏中分离出B细胞?

对此，需要先了解哺乳动物B细胞的种类，其分化过程可分为前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞五个阶段。按照这个定义，B细胞应该包括浆细胞。

那么，到底是应该用成熟B细胞还是用浆细胞进行融合呢?两者都不可以。由于成熟B细胞未接受抗原刺激，不能产生抗体，但是浆细胞也不适用于细胞融合。有研究证实，小鼠注射抗原后7～8d产生抗体达到高峰，也就是7～8d后浆细胞产生达到高峰，但是取此时的细胞和骨髓瘤细胞融合效率很低。若取免疫后3d的细胞，则融合的效率最高。而此时B细胞正处于从成熟B细胞向浆细胞分化的时期，也就是活化B细胞时期。

所以，用于细胞融合的是接受过抗原刺激的活化B细胞。其次，在实际操作过程中，是直接使用经过免疫的小鼠脾脏的单细胞悬液，而不需要再从脾脏中分离B细胞。因为融合后的细胞悬液中除了杂交瘤能在筛选培养基上生长，其他融合形式的细胞以及未融合的细胞均不能生长而被淘汰。

2．杂交瘤细胞的筛选

不少学生误认为筛选杂交瘤细胞是在培养基中加入抗生素。学生疑惑：与基因工程的筛选原理一样吗?

细胞融合的结果会得到三大类细胞：B细胞和B细胞互相融合的细胞，瘤细胞和瘤细胞互相融合的细胞，杂交瘤细胞。第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(TK－)或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT－)缺陷。

细胞分裂DNA复制过程中，所需的核苷酸有两个途径(图1)：全合成途径(也称起始合成途径)和补救合成途径(也称中间合成途径)。正常细胞内两种途径都具备。全合成途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，氨基喋呤(aminopterin，A)可以抑制其合成；补救合成途径需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和次黄嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)，其次还需要次黄嘌呤(hypoxanthine，H)及胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)作为原料。正常细胞有这两种酶，而TK－和HGPRT－缺乏其中之一不能通过补救合成途径合成核苷酸。加入次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)的培养基称HAT培养基。

在这种培养基上TK－和HGPRT－骨髓瘤细胞全合成途径被A阻断，而缺乏TK或者HGPＲT又不能进行补救合成途径，因此无法繁殖，最终死亡。而杂交瘤细胞具备B细胞的遗传物质，培养基中又加入H和T，可以进行补救合成途径。同时，又因为具有瘤细胞的遗传物质，可以无限增殖。因此，最终在HAT培养基上只有杂交瘤细胞可以增殖，其他细胞全部死亡。所以，称HAT培养基为筛选培养基。

通过比较，可以把基因工程的筛选原理看做“加法”，而单克隆抗体的筛选原理看做“减法”。所谓的“加法”是使目的细胞增加了抗生素抗性基因，使之可以在含抗生素的培养基上存活；所谓的“减法”是使非目的细胞减少了一些必需基因，使之不能在筛选培养基上存活，同样也达到筛选细胞的目的。

3．两次专一抗体检验阳性

在制备单克隆抗体的过程中要进行至少两次专一抗体检验阳性，学生不容易理解多次专一抗体检验阳性这个概念。

融合后细胞是用细胞培养板来培养的，此时每个孔里加的是HAT培养基。培养的结果是有的孔有细胞，即有杂交瘤细胞；有的孔可能没有细胞，也就是无杂交瘤细胞。

但是，有细胞的孔并不是都能产生目标抗体，有可能产生的是其他抗体。这是因为脾细胞中包含多种B细胞，它们产生的是不同的抗体。为了得到目标抗体，当然要进行检测，这就是所谓的“专一抗体检验”。“阳性”是一种术语，代表“存在”；“阴性”代表“不存在”。“检验阳性”的意思就是有这种抗体。被检验为阳性的孔称为“阳性孔”，这个孔里的细胞才有进行下一步处理的价值。这是第一次“专一抗体检验”。

阳性孔中的细胞除了含有分泌需要的特异性抗体的细胞外，还可能含有分泌其他抗体的细胞，也可能含有不分泌抗体的细胞，所以不能直接把阳性孔的细胞用以生产单克隆抗体。要进行第二次筛选，这个步骤称为“杂交瘤细胞的克隆化”。

所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞集团的整个培养过程。

常用的方法包括有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法等。有限稀释法的简要过程就是将阳性孔细胞计数，将计数后的细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，再把稀释液接种到细胞培养板，按每孔接种0.1mL细胞悬液，即每孔含1个细胞。其他方法原理和操作不同，但是最终目的都是每个孔中接种1个细胞。如此每个孔中培养出来的细胞都是单克隆细胞。

接下来就要进行第二次“专一抗体检验”，结果为阳性的细胞就是能分泌目标抗体的单克隆细胞，这些细胞就可以进行大规模的培养。教材中提到可能要进行多次“专一抗体检验”，是因为进行一次有限稀释法可能得到的不是单克隆细胞，要进行第三次甚至更多次的有限稀释和克隆化培养，还要再进行第三次甚至更多次“专一抗体检验”。

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